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根癌农杆菌介导的雪莲冷诱导蛋白基因对薰衣草的遗传转化
邢文超
Thesis Advisor曹旭
2006-06-09
Degree Grantor中国科学院研究生院
Place of Conferral北京
Degree Name硕士
Degree Discipline生物有机化学
Keyword薰衣草 农杆菌 遗传转化 Pcr Southern杂交
Abstract

新疆是我国薰衣草主要的种植基地,其种植面积约为1400 hm2,占全国薰衣草种植面积的95%以上。但是,与地中海地区不同,新疆地处欧亚大陆腹地,荒漠面积大,昼夜温差大,冬季异常寒冷。环境差异导致了新疆薰衣草的品质退化,严重影响了它的国际市场竞争力。因此,本文的目的就是探索孟士德薰衣草遗传转化方法并通过雪莲冷诱导蛋白基因的导入提高新疆薰衣草的抗冻能力。本论文分为三个部分。第一部分对雪莲冷诱导蛋白基因植物表达载体的构建进行了详细的讨论。通过选择pCAMBIA1304质粒上合适的酶切位点,利用质粒本身的表达调控因子构建了紧密型植物表达载体。构建过程包括目的基因的PCR扩增,目的基因和质粒DNA的酶切与连接以及导入根癌农杆菌(EHA105)等步骤。最后得到的植物表达载体含有雪莲冷诱导蛋白基因scp、植物选择标记基因hptⅡ以及报告基因gus和gfp。第二部分对薰衣草遗传转化受体系统的建立进行了详细的探讨。本文选择薰衣草子叶和下胚轴为外植体材料,通过探索不同植物激素组合对薰衣草不定芽分化的影响以及抗生素敏感性实验建立了薰衣草遗传转化受体系统。结果表明:下胚轴的不定芽分化能力比子叶更强,在IAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L条件下,10 d苗龄的下胚轴的出愈率和不定芽分化率分别为96.7%和36.7%,组培苗在1/2MS基本培养基上生根率可达95%以上。确定了下胚轴适宜的抗生素筛选浓度,潮霉素的筛选浓度为10 mg/L,头孢霉素浓度为200 mg/L时即可有效抑制农杆菌的生长,同时又不会对薰衣草不定芽分化产生明显的伤害作用。植株的再生历程只需要30 d左右,比从愈伤诱导获得再生植株的时间缩短2个月左右。第三部分对农杆菌介导的薰衣草高效遗传转化体系的建立以及转基因薰衣草的验证进行了详细的讨论。本论文全面地考察了影响外植体遗传转化频率的多种因素,包括预培养时间、浸染时间、共培养条件、恢复培养条件以及乙酰丁香酮(AS)浓度等。结果表明:预培养6 d的下胚轴在添加100 µmol/L乙酰丁香酮的农杆菌重悬液中浸染10 min后共培养2~3 d,经过7~10 d的恢复培养之后用包含10 mg/L潮霉素B和200 mg/L头孢霉素的筛选培养基进行筛选是较为理想的遗传转化条件。报告基因gus和gfp在转化植株中的正常表达说明本论文建立的薰衣草遗传转化方法是成功的。通过PCR和Southern 杂交等核酸分子水平检测进一步确证了外源目的基因的转化率及其在薰衣草基因组中的整合情况,结果表明,雪莲冷诱导蛋白基因(scp)的转化率为40%。

Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.xjipc.cas.cn/handle/365002/3466
Collection资源化学研究室
Recommended Citation
GB/T 7714
邢文超. 根癌农杆菌介导的雪莲冷诱导蛋白基因对薰衣草的遗传转化[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2006.
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根癌农杆菌介导的雪莲冷诱导蛋白基因对薰衣(1373KB)学位论文 开放获取CC BY-NC-SAApplication Full Text
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